promvet_admin Комментариев нет

В лабораторных условиях исследованы бактериостатические и минимальная бактерицидная концентрации средства «Вироцид» с использованием тест-микроорганизмов 1,2 групп устойчивости, снижение активности дезинфицирующего средства в присутствии высокосолекулярного действия при обеззараживания контаминированных вирусом АЧС поверхностей, имитирующих объекты животноводческих помещений, с подтверждением полноты инактивации вируса поставкой биопробы на восприимчивых животных.

ВВЕДЕНИЕ

В системе санитарных, противоэпидемических и противоэпизоотических мероприятий, обеспечивающих благополучие страны по инфекционным болезням, повышение продуктивности животных и санитарное качество продуктов, сырья и кормов животного происхождения, дезинфекция занимает одно из важных мест. Под дезинфекцией понимают уничтожение на объектах внешней среды или удаление из них патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Основное назначение дезинфекции — разорвать эпизоотическую цепь путем воздействия на ее важнейшее звено — фактор передачи возбудителя болезни от источника инфекции к восприимчивому организму.

В последние годы на рынке дезинфицирующих средств представлен весьма большой ассортимент препаратов как отечественного, так и зарубежного производства, но при всем многообразии дезинфицирующих средств, количество компонентов, входящих в их состав, весьма ограничено, причем целый ряд соединений обладает высокой бактерио- и вирусстатической активностями и низким бактерицидным и вирулицидным действием, что не позволяет им эффективно обеззараживать контаминированные поверхности, особенно загрязненные органическими веществами. Особую актуальность проблема внедрения новых высокоэффективных дезинфектантов приобрела в последние 3 года, в связи с продолжающимся распространением по территории РФ занесенной в 2007 году африканской чумы свиней, представляющей реальную угрозу свиноводству страны. Так как при АЧС отсутствуют средства специфической профилактики, а, как показал анализ эпизоотических вспышек болезни, ведущую роль в их возникновении играет человек — зараженное мясо перевозится различными видами транспорта из одного региона в другой, очевидно, что в предотвращении дальнейшего распространения болезни одним из важнейших мероприятий является проведение дезинфекции. Учитывая биологические особенности вируса и то, что для большинства дезинфектантов      не изучена их вирулицидная активность в отношении вируса АЧС, целесообразно проведение работ по обеспечению ветеринарной дезинфекционной практики новыми высокоэффективными дезсредствами.

 

Одним из перспективных дезинфектантов является средство «Вироцид», основные действующие вещества которого четвертично-аммониевые соединения и глутаровый альдегид. Ранее было установлено, что «Вироцид» обладает широким спектром бактерицидного и вирулицидного действия в отношении микроорганизмов различных групп устойчивости, включая спорообразующие. «Вироцид» эффективен при агрессивных факторах окружающей среды, таких как ультрафиолетовое излучение, присутствие солей в воде, придающих жесткость (до 400 мг/л солей кальция) и на поверхностях с остаточным органическими загрязнениями. Вироцид при этом является рН нейтральным, т.е. не агрессивен для чувствительных материалов транспорта и оборудования, щадящее относится к обрабатываемым поверхностям, высоко стабилен и биобезопасен в применении. Температурный диапазон « Вироцида» от 5 до 800 С (с антифризовой добавкой и до -200С) при длительности действия препарата до 7 суток.

Таким образом, учитывая наличие пористых поверхностей в помещениях для содержание свиней, остаточных загрязнений на дезинфицируемых площадях и, зачастую, высокое содержание миниральных солей в воде, используемой для приготовления рабочих растворов, для пополнения  арсенала практикующих ветеринарных специалистов эффективными дезсредствами целесообразно проведение испытаний дезинфицирующей активности средства «Вироцид» в отношении вируса АЧС.

1.ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЙ

Образец дезинфицирующего средства «Вироцид» производства СИД ЛАЙНС НВ/СА (Бельгия).

2. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЙ

Определить спектр антимикробного действия средства «Вироцид» в отношении тест-микроорганизмов 1, 2 групп устойчивости.

Определить дезинфицирующую активность средства «Вироцид» в отношении вирулентного штамма вируса африканской чумы свиней (АЧС) на контаминированных вирусом поверхностях, имитирующих объекты животноводческих помещений.

3.ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Испытания проводили в период с 28 апреля 2011 г по 30 июня 2011 года в соответствии с «Методами испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности», утвержденными Главным государственным санитарным врачом РФ, М., 1998 г, «Методическими указаниями о порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики», утвержденными ГУВ Госагропрома СССР в 1987 г, с использованием биопробы и «Методическими указаниями по отбору, оценке и испытаниям антивирусного и антибактериального действия химических соединений» М., 2004 г.

4. ОЦЕНИВАЕМЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ

Инфекционная активность вируса АЧС изолят Ставрополь в первичной культуре клеток костного мозга свиней.

Минимальные бактериостатическая и бактерицидная концентрации средства «Вироцид».

Токсичность (МИД) средства «Вироцид» для первичной культуры клеток костного мозга свиней (ККМС).

Дезинфицирующее действие средства «Вироцид» производства СИД ЛАЙНС НВ/СА (Бельгия) на вирус АЧС в культуре ККМС с использованием тест-объектов из впитывающего (бетон) и не впитывающего (полимерное покрытие) материалов.

Дезинфицирующее действие средства «Вироцид» производства СИД ЛАЙНС НВ/СА (Бельгия) на вирус АЧС с использованием тест-объектов (бетон) и постановкой биопробы на подсвинках массой 18-25 кг.

5.МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИСПЫТАНИЙ

5.1. Получение культур тест-микроорганизмов

В пробирки со скошенным триптон-соевым агаром засевают предварительно проверенные на отсутствие посторонней контаминации бактериальной и грибной микрофлорой культуры тест-микроорганизмов (Escherichia coli и Staphylococcus aureus) в посевной дозе 103-106/мл. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 18-20 ч. Суточные культуры контролируют на отсутствие контаминаитов. Для этой цели из полученных культур готовят мазки, окрашивают по Граму и подвергают световой микроскопии. Затем агаровые культуры смывают физиологическим раствором.

5.2. Определение бактерицидной и бактериостатической активности методом серийных разведений.

Для определения минимальной бактерицидной концентрации средства «Вироцид» готовили его серийные двукратные разведения на мясо- пептонном бульоне (МПБ) от 0,5 % до 0,0009% в объеме 2,0 мл.

При приготовлении заражающей суспензии определяли исходную концентрацию бактериальных клеток в смывах с агаровых культур тест- микроорганизмов (Е. coli штамм 0:157 и S. aureus штамм 209-Р) с использованием стандарта мутности, после чего готовили рабочее разведение инокулюма в концентрации 1 х 107 м.к./мл.

В приготовленные разведения средства вносили инокулюм одной из культур в объеме 0,2 мл и инкубировали при температуре 370С.

Результаты учитывали визуально через 18-20 часов инкубации при 37°С по появлению роста культуры в пробирках (бактериостатическое действие).

Контролем служили бульонные культуры микроорганизмов, в которые препарат не вносился.

Бактерицидное действие средства изучали по окончании исследований по определению бактериостатического действия. Для этого из пробирок, в которых видимый рост отсутствовал, по 0,2 мл высевали на МПА. Посевы продолжали инкубировать при 37°С и через 5 суток повторяли процедуру пересева на МПА. Пересевы инкубировали при 37°С в течение 18-24 часов, после чего проводили учет результатов.

Минимальной бактерицидной дозой является та доза средства, при которой отсутствовал рост микроорганизма на МПА.

Для изучения влияния высокомолекулярного белка на антимикробную активность проводили аналогичные испытания с добавлением в МПБ нормальной сыворотки крови лошади в конечной концентрации 40 %.

5.3. Определение инфекционной активности вируса АЧС в культуре клеток.

Для определения инфекционной активности вируса АЧС готовили его десятикратные разведения, которые вносили в культуральные матрасы с ККМС. Продолжительность инкубации 7 дней. В контрольные культуральные матрасы с ККМС вируссодержащая жидкость не вносилась.

5.4. Оценка токсичности средства «Вироцид» для культуры клеток.

Для определения максимально-переносимой дозы средства «Вироцид» готовили его двукратные разведения, которые вносили в культуральные матрасы     с культурой ККМС. Продолжительность инкубации 7 дней. В контрольные культуральные матрасы с ККМС средство не вносили.

За МПД принимали высшую концентрацию препарата, которая не вызывала изменений культуры клеток.

5.5. Оценка дезинфицирующего действия средства «Вироцид» in vitro и in vivo.

При исследованиях с вирусом, использовали вирулентный вирус АЧС. На стерильные тест-объекты, имитирующие объекты животноводческих помещений из бетона и полипропилена наносили по 1,5 мл вируссодержащей жидкости на 100 см2. В качестве механической защиты вируса использовали стерильный свиной навоз в количестве 0,3 г. сухого вещества на 100 см2 поверхности, что составило 20% органических веществ в вируссодержащей жидкости. Перед нанесением на поверхность в вируссодержащую суспензию тщательно перемешивали с соответствующим количеством навоза. Смесь равномерно распределяли на поверхности тестов, после чего их подсушивали 1-2 часа. Испытуемые 0,25-2,0 %-ные растворы средства «Вироцид» равномерно наносили методом орошения на тест-объекты, из расчета 0,3 л/м2 площади.

На контрольные тест-объекты, вместо раствора средства «Вироцид» наносили такое же количество водопроводной воды, которая использовалась для приготовления раствора средства.

С обработанных растворами дезинфектанта тесг-объектов, испытуемые материалы отбирали через 0,5-3,0 часа. Вирусный материал соскабливали, добавляли по 4,5 мл среды Хенкса, экстрагировали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем центрифугировали 15 минут при 3000 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость сразу использовали для заражения культуры ККМС с последующими двумя пассажами, а также для постановки биопробы на подсвинках. Биопробу проводили на 20 животных: 18 — опытных и 2 — контрольных.

Наблюдение за культурой клеток вели в течение 14 дней с учетом двух последовательных пассажей, а за заражёнными подсвинками — в течение 21 суток.

Опыты сопровождались следующими контролями:

—    определение инфекционного титра в вируссодержащем материале;

—    снижение титра инфекционности вируса в результате обработки инфицированных поверхностей водой.

6. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ

Антимикробную активность средства «Вироцид» изучали в жидких и на твердых питательных средах с возбудителями колибактериоза и стафилококкоза с использованием белковой нагрузки и без нее.

Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли методом серийных разведений в МПБ с последующим высевом на МПА на чашках Петри.

В таблице 1 представлены результаты изучения бактериостатического и бактерицидного действия средства «Вироцид».

Тест-

микроорг.

Вид

действия

Белковая

защита

Концентрация средства, % от исходного
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Е. coli Бактерио

статич.

нет +
есть + + + + +
Бактери

цидн.

нет +
есть + + + + +
S. aureus Бактерио

статич.

нет +
есть +
Бактери

цидн.

нет +
есть + +

Примечание: 1 — 0,5 %; 2 — 0,25 %, 3 — 0,125; 4 — 0,0625; 5 — 0,0312; 6 — 0,0156; 7 — 0,0078, 8 — 0,0039; 9 — 0,0019, 10 — 0,0009; — — роста нет; + — рост есть

В результате проведенных испытаний установлено, что средство «Вироцид» обладает выраженной антимикробной активностью в отношении тест-культур грамположительных (S. aureus) и грамотрицательных (Е. coli) микроорганизмов обеспечивая их инактивацию при концентрациях 0,0019 % от исходной (таблица 1). При добавлении высокомолекулярного белка происходит снижение бактерицидной активности.

При определении инфекционной активности вируса АЧС изолят Ставрополь в виде вирус-крови установлено, что титр вируса в культуре ККМС составляет 7,00 lg ГАЕ50/мл (гемадсорбирующих единиц).

Данные по оценке токсичности средства «Вироцид» для культуры клеток костного мозга свиней представлены в таблице 2.

Таблица 2. Оценка токсичности средства «Вироцид» для культуры клеток костного мозга свиней.

Наименование

препарата

Конц- я, % Культура

клеток

Срок наблюдения (суг)
1 2 3 4 5 6 7
«Вироцид» 2,0 ККМС + + + + + + +
1,0 + + + + + + +
0,5 + + + +
0,25 + +
0,125

 

Примечание: «-» — отсутствие дегенерации монослоя клеток; «+» — наличие дегенерации.

Как видно из представленных в таблице 2 данных средство «Вироцид» в концентрациях 0,125% и ниже не токсичен для культуры клеток костного мозга свиней, в течение 7 суток наблюдения.

Результаты испытаний дезинфицирующего действия средства «Вироцид» в культуре ККМС представлены в таблице 3.

Из данных, представленных в таблице 3 видно, что средство «Вироцид» в концентрации 0,5 %, экспозиции 30 минут и норме расхода 0,3 л/м2 полностью инактивирует вирус АЧС на невпитывающих и частично — на впитывающих тест-поверхностях. В концентрации 0,5 % и экспозиции 1,0 час, а также 1,0% и экспозиции 30 минут с нормой расхода 0,3 л/м средство обеззараживает контаминированные вирусом АЧС опытные тест-поверхности из не впитывающих и впитывающих материалов с белковой защитой в виде свиного навоза при испытаниях в культуре ККМС.

Таблица 3 Определение в культуре ККМС дезинфицирующего действия средства «Вироцид» при обеззараживании тест-объектов,

контаминированных вирусом АЧС.

Концентрация действующего вещества, % Норма

расхода,

л/м2

Экспозиция,

час

Полипропилен Бетон
0,25 0,3 0,5 +/+/ + +/ +/ +
1,0 -/-/ + +/ +/ +
0.5 0,3 0,5 -/-/ — +/+/+
1,0 -/-/ —  

-/-/ —

1,0 0,3 0,5 -/-/ — -/-/ —
1,0  

-/-/ —

-/-/ —
2,0 0,3 0,5 -/-/ — -/-/ —
1,0 -/-/ — -/-/ —
Контроль   0,25; 0,5; 1,0; 2,0 +/+/+ +/+/+

 

Примечание: + — означает наличие вируса АЧС;

—  — означает отсутствие вируса.

Результаты испытаний дезинфицирующего действия средства «Вироцид» в отношении вируса АЧС с использованием биопробы представлены в таблице4.

Таблица 4 Определение в биопробе дезинфицирующего действия средства«Вироцид» при обеззараживании тест-объектов из бетона,

контаминированных вирусом АЧС.

№ п/п Конц-я раствора по препарат)’, % Норма

расхода,

л/м2

Экспозиц ия, час Тест-поверхности
Бетон
пало/всего
1 0,5 0,3 1,0 3/3
2 1,0 0,3 0,5 3/3
3 0,3 1,0 3/3
4 0,3 3,0 1/3
5 0,5 3,0 0/3
6 2,0 0,3 1,0 0/3
7 Контроль     2/2

Из данных таблицы 4 видно, что при орошении средством «Вироцид» тест-объектов, контаминированных вирусом АЧС с белковой защитой в виде свиного навоза, поверхности из бетона были обеззаражены 2,0 %-ным раствором при экспозиции 1 час и норме расхода 0,3 л/м2 и 1,0% -ным раствором при экспозиции 3 часа и норме расхода 0,5 л/м2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Дезинфектант «Вироцид» по результатам лабораторных исследований обладает выраженной бактерицидной и бактериостатической активностями в отношении тест-культур грамположительных (S. aureus) и грамотрицательных (Е. coli) микроорганизмов обеспечивая их инактивацию при концентрациях 0,0019 % от исходной

На основании проведенных исследований в культуре клеток костного мозга свиней (in vitro) установлено, что полное обеззараживание впитывающих и невпитывающих тест-поверхностей, имитирующих объекты животноводческих помещений, контаминированных вирулентным эпизоотическим изолятом вируса АЧС с белковой защитой в виде свиного навоза, было достигнуто при однократном орошении 0,5 %-ным раствором средства «Вироцид» с экспозицией 1 час и 1,0%-ным раствором средства при экспозиции 30 минут с нормой расхода 0,3 л/м2. Это свидетельствует о высокой вирулицидной активности дезинфектанта «Вироиид»в отношении вируса АЧС.

При испытаниях на сельскохозяйственных животных (биопроба) установлено, что полное обеззараживание тест-поверхностей (бетон), имитирующих объекты животноводческих помещений и контаминированных вирулентным эпизоотическим изолятом вируса АЧС с белковой защитой в виде свиного навоза, было достигнуто при однократном орошении 1,0 %-ным раствором дезинфектанта «Вироцид» при норме расхода 0,5 л/м2 с экспозицией 3 часа и 2,0 %-ным раствором средства «Вироцид» при расходе 0,3 л/м2 и экспозиции 1 час.

Таким образом, дезинфицирующий препарат «Вироцид» обладает выраженным вирулицидным действием и рекомендуется для применения в очагах заражения АЧС для обработки объектов ветеринарного надзора в соответствии с «Правилами проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора», утвержденными

Департаментом ветеринарии МСХ РФ 16.07.2002г. с целью полной инактивации вируса АЧС и предотвращения его распространения