promvet_admin Комментариев нет

Оценка эффективности дезинфицирующего средства «вироцид» (cid lines, innovative hygiene solutions) в рекомендуемой производителями концентрации 0,25% против вируса африканской чумы свиней

  1. Цели.

Целью этого исследование было испытание дезинфектанта «Вироцид» (Virocid) (CID LINES, Innovative Hygiene Solutions) с целью оценки вирулицидной активности in vitro против вируса африканской чумы свиней (ВАЧС) в присутствии и в отсутствие мешающего анализу вещества (инактивированная эмбриональная бычья сыворотка, iFBS) с целью имитации загрязнения органического происхождения, которое может снизить вирулицидную активность дезинфицирующих средств при коммерческом разведении, рекомендуемом производителями. Эффективное рабочее разведение дезинфектанта «Вироцид» было установлено производителями на уровне 0,25%.           

  1. Материалы и методы.

2.1.      Вирусный штамм и культуры клеток.

Клетки VERO (линия клеток почки африканской зеленой мартышки, на которых выращивают вирусные культуры) получали из Американской коллекции типовых культур (ATCC) и выращивали в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), в которую добавляли 10% эмбриональной бычьей сыворотки (SFB). В ходе исследования использовали адаптированный к культуре клеток VERO испанский штамм BA71V вируса африканской чумы свиней, который относится к p72-генотипу I. Титр изолята ВАЧС оценивали по конечному разведению в клетках Vero с использованием метода Рида-Мюнча (Reed & Muench) (1938) и выражали, как 50% дозы, инфицирующей культуру ткани, в 1 мл (TCID50/мл).           

 

2.2.      Контроль цитотоксичности дезинфектанта для культуры клеток Vero.

В ходе предыдущего исследования, проведенного в 2011 г., для определения цитотоксичности 10-кратные разведения дезинфектанта (от 10-1 до 10-21) готовили в среде для культуры клеток, в которую добавляли 2% сыворотки iSFB в конечном объеме 500 мкл, и в двух повторностях добавляли в 48 чашек на монослои клеток Vero. Диапазон  включал эффективное рабочее разведение на уровне 0,5% или в соотношении 1:200, как рекомендуется производителями. Морфологические изменения в клетках Vero отмечались под микроскопом, начиная с 24 и вплоть до 72 часов после добавления дезинфектанта «Вироцид». Структурные изменения сравнивали с изменениями в контрольных клетках Vero без добавления дезинфектанта, которые поддерживали в культуральной среде с добавлением 2% сыворотки iSFB.           

 

2.3.      Вирулицидная активность дезинфектанта «Вироцид» против вируса африканской чумы свиней в присутствии или в отсутствие мешающего анализу вещества (iFBS) с использованием эффективного рабочего разведения на уровне 0,25%. 

 

Метод, примененный для определения вирулицидной активности, соответствует стандарту UNEEN 14675-2007 «Количественное испытание суспензии для оценки вирулицидной активности химических дезинфицирующих средств и антисептиков, используемых в ветеринарии» с небольшими модификациями, которые можно описать следующим образом:           

  • Разведения суспензии вируса. Двукратные разведения в диапазоне 1/20 — 1/1280 изолята Ba71V вируса африканской чумы свиней с начальным титром на уровне 2,1 x 1012 TCID50/мл готовили в среде для культуры клеток, в которую добавляли 2% сыворотки iSFB.           
  • Испытание суспензии проводили в стерильной воде или мешающем анализу веществе (iSFB) с использованием каждого из разведений вируса и дезинфектанта «Вироцид» (Virocid) при конечной концентрации на уровне 0,25%, как рекомендуется производителями. После смешивания всех компонентов пробирки инкубировали в течение 30 мин при температуре 10°C ± 1°C.           
  • После периода инкубации 48 монослоев культуры клеток Vero в чашках для культивирования при 80% степени смыкания монослоя инокулировали каждой суспензией в двух повторностях. В анализ включали клетки, инфицированные вирусом африканской чумы свиней, без дезинфектанта и лунки с контрольными клетками без добавления вируса.          
  • Цитопатический эффект в клетках Vero наблюдали под микроскопом по сравнению с контрольными клетками, начиная с 24 и вплоть до 96 часов после инокуляции.

 

2.4.      Определение вирулицидной активности in vitro с использованием эффективного рабочего разведения на уровне 0,25%. 

Вирулицидная способность дезинфектанта «Вироцид» в отношении вируса африканской чумы свиней первоначально была установлена через 24, 48, 72 и 96 часов после инокуляции путем прямого окрашивания инфицированных клеток Vero, зафиксированных с помощью холодного раствора 70% метанола и 30% ацетона с использованием иммунопероксидазной методики (IPT). Вкратце, инфицированные клетки инкубировали с образцом положительной по АЧС стандартной сыворотки, разбавленным в соотношении 1/80, и протеин-A/пероксидазу из хрена использовали в качестве вторичного антитела (1/5000) для обнаружения комплексов антиген/антитело, образуемых в цитоплазме клеток Vero, инфицированных вирусом африканской чумы свиней. Реакцию проявляли с помощью раствора субстрата (3-аминэтилкарбазол-диметилформамида, разбавленного в ацетатном буфере). Вирулицидную способность, в конечном итоге, оценивали путем подсчета количества клеток, окрашенных в красный цвет, по сравнению с контрольными лунками.           

          

С целью подтверждения способности дезинфектанта «Вироцид» ингибировать репликацию вируса ВАЧС, 48 монослоев культуры клеток Vero в чашках для культивирования при 80% степени смыкания монослоя инокулировали каждой суспензией в двух повторностях, как описано в разделе 2.3. Инокулированные клетки Vero инкубировали во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 при температуре 37°C в течение 72 часов и подвергали одному циклу замораживание/оттаивание. Супернатанты культур центрифугировали в течение 5 мин при 650g для освобождения от остатков клеток и использовали в качестве инокулята для последующего пассажа на клетки Vero (не более трех слепых пассажей). Общую ДНК экстрагировали из 200 мкл каждого супернатанта, полученного из клеток Vero, инокулированных с использованием либо обработанного дезинфицирующим средством «Вироцид» вируса африканской чумы свиней, либо необработанного вируса и восстанавливали в конечном объеме 50 мкл с использованием тест-набора высокоочищенной вирусной нуклеиновой кислоты (High Pure Viral Nucleic Acid от компании Roche) в соответствии с инструкциями производителя. Для подтверждения репликации вируса африканской чумы свиней использовали метод ПЦР в режиме реального времени (King et al., 2003), рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения животных (МЭБ) для диагностики АЧС. В описанном методе ПЦР в режиме реального времени для вируса африканской чумы свиней используют набор праймеров и специфический зонд TaqMan, специфичный к высоко консервативной области вирусного генома (область VP72), что обеспечивает обнаружение широкого диапазона изолятов ВАЧС. Праймеры амплифицируют фрагмент ДНК из 250 пар нуклеотидных оснований от нуклеотида в положении 2041 до нуклеотида в положении 2290 полной последовательности гена VP72 эталонного штамма BA71V (GenBank, номер доступа: M34142). Зонд TaqMan, примененный для обнаружения амплифицированного продукта, помечен репортёром в 5′-конце [6-карбокси-флуоресцеин (FAM)] и тушителем флуоресценци в 3′-конце [6-карбокси-тетраметил-родамин (TAMRA)].           

  1. Результаты.

Перед проведением оценки вирулицидной активности дезинфектанта «Вироцид» от компании CID Lines в рекомендуемой концентрации 0,25%, цитотоксичность на клетках Vero была установлена в ходе предшествующего исследования, проведенного в 2011 г. Признанное не-цитотоксичным для клеток Vero максимальное разведение дезинфектанта «Вироцид» был установлено на уровне 10-8. Это разведение было выбрано и впоследствии применено для определения вирулицидной активности на монослоях клеток Vero.           

Оценка вирулицидной активности против вируса африканской чумы свиней с эффективным рабочим разведением на уровне 0,25% или в соотношении 1:400, как рекомендуется производителями,продемонстрировала полное ослабление специфического цитопатического эффекта через 24, 48 и 72 часов после инокуляции, о чем судили с помощью иммунопероксидазной методики. Полное ослабление специфического цитопатического эффекта отмечалось даже после использования самого низкого разведения вируса африканской чумы свиней (1/20), что соответствует титру вируса на уровне 1011 TCID50/мл. Это 100%-е снижение специфического цитопатического эффекта было продемонстрировано во всех случаях, как в отсутствие, так и в присутствии мешающего анализу вещества (iFBS).           

Для подтверждения ингибирующего эффекта дезинфектанта «Вироцид» на репликацию ВАЧС, общую ДНК экстрагировали из клеток Vero, инокулированных в ходе 3 последовательных пассажей вирусом африканской чумы свиней, обработанным препаратом «Вироцид», либо не обработанным вирусом ВАЧС, анализировали с использованием метода ПЦР в режиме реального времени. Как можно видеть на Рис. 1, в клетках, инокулированных не обработанным вирусом ВАЧС с использованием самого низкого разведения вируса (1/20), значения CT для каждого из трех пассажей были сниженными, что указывает на активную репликацию вируса в клетках после его инокуляции. Напротив, в клетках, инокулированных вирусом, обработанным препаратом «Вироцид», отмечалось полное отсутствие ДНК вируса африканской чумы свиней (Ct>40) по результатам анализа методом ПЦР в режиме реального времени после трех пассажей, что свидетельствует о полной инактивации вируса. Таким образом, на основе фенотипических (цитопатический эффект) и молекулярных данных можно сделать вывод о том, что инвазионная способность вируса полностью отсутствовала после обработки вируса африканской чумы свиней дезинфицирующим средством «Вироцид» в концентрации 0,25%, что подтверждается отсутствием цитопатического эффекта и отсутствием ДНК вирусного генома в ходе трех последовательных пассажей в культуры клеток.            

 

 

Рис. 1. Результаты анализа методом ПЦР в режиме реального времени клеток Vero, инфицированных не обработанным вирусом африканской чумы свиней (контрольный вирус, зеленая линия), инфицированных вирусом африканской чумы свиней, обработанным препаратом «Вироцид», в присутствии интерферирующего вещества (iSFB, красная линия), а также клеток Vero, инфицированных вирусом африканской чумы свиней, обработанным препаратом «Вироцид», в отсутствие интерферирующего вещества (вода, синяя линия). Результаты выражены в значениях CT после трех последовательных пассажей (Passage) на клетки Vero.         

 

 

Заключение. 

Оценка in vitro продемонстрировала, что дезинфектант «Вироцид» от компании CID LINES при разведении в концентрации 0,25% оказался способным снизить на 100% специфический цитопатический эффект, оказываемый изолятом Ba71V вируса африканской чумы свиней (ВАЧС) на клетки Vero и, в силу этого, предотвращать репликацию ВАЧС в этих клетках даже при высокой концентрация вируса вплоть до 1011 TCID50/мл.

Отчет подготовили доктора Кармина Гальярдо, Ракель Ньето и Мариса Ариас. 

 

(Подпись)             (Подпись, печать)          
Доктор Кармина Гальярдо         

Координатор лаборатории при АЧС-СЛЕС

 

Доктор Мариса Ариас         

Технический директор CISA-INIA

 

Вальдеольмос, Мадрид, Испания, 30 июня 2012 г.